财富家
撰文 | Qi
胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）是当前代谢性疾病治疗中的热门靶点。GLP-1受体激动剂（GLP-1RAs）不仅在降糖、减重方面表现突出，还具有显著的抗炎作用。然而，这些药物是否通过直接作用于免疫细胞上的GLP-1R来发挥免疫调节功能，至今仍存在争议。以往多项研究依赖商用抗体如AGR-021（Alomone Labs） ， 针对大鼠GLP-1R的细胞外结构域制备而成，被用于检测小鼠和人类T细胞中免疫反应性GLP-1R的表达，并用于对GLP-1R+与GLP-1R−的T细胞进行表型分析。 然而， 使用AGR-021抗体所生成的数据的解读存在几个问题 ，例如 在主要免疫器官中Glp1r mRNA的水平非常低，但使用AGR021检测到的GLP-1R免疫反应性免疫细胞却具有非常广泛的分布【1】，以及 使用AGR-021进行的蛋白质印迹实验报告了一个110kDa的GLP-1R免疫反应性条带，但并非预期的GLP-1R的分子量（约55kDa）【2, 3】等。总之 ，这些观察结果表明AGR-021免疫反应可能不能准确地反映真实的GLP-1R表达情况。若抗体不可靠，则所有基于此类抗体的细胞分选、功能实验乃至临床转化结论，都可能建立在错误的前提之上。
2025年9月2日，来自多伦多西奈山医院的Daniel J. Drucker团队在Cell Metabolism杂志上发表了一篇题为Reassessment of antibody-based detection of the murine T cell GLP-1 receptor的文章，他们通过多种技术手段（免疫荧光、免疫组化、流式细胞术、Western blot），结合两种独立构建的全身性GLP-1R敲除小鼠模型，系统评估了三种常用GLP-1R抗体（尤其是AGR-021）的可靠性，证明AGR-021抗体不具备特异性，不能用于可靠检测小鼠GLP-1R，并呼吁领域内重新评估以往基于该抗体的研究结论，并强调在多技术验证的基础上使用抗体。
该团队 首先分离了野生型与GLP-1R敲除（Glp1r ⁻/⁻ ）小鼠的胰岛，使用高特异性荧光探针LUXendin645（能与GLP-1R 高特异性结合）与抗体进行共染色 ， 作为对照的 GLP-1R抗体ab218532与LUXendin645在野生型胰岛中有强烈的共定位，但在GLP-1R缺失型胰岛中没有信号，相比之下，AGR-021与LUXendin645重叠程度极小， 且 在GLP-1R缺失型胰岛中产生了弥漫的细胞质荧光信号， 表明AGR-021不具备特异性识别GLP-1R的能力。 此外，他们还 在另一种独立构建的GLP-1R敲除小鼠（Glp1rᴰ⁻ᴷ⁰）的组织切片中进行 免疫组化 验证 ， 观察到 ab218532仅在野生型胰岛中染色，敲除型中几乎无信号 ， 而 AGR-021在两类小鼠中染色模式相似 。 在 Brunner’s腺（高表达GLP-1R） 中， ab218532显示膜定位信号，敲除型中消失 ， 而 AGR-021则出现强烈的核染色，且与基因型无关。 在 胸腺 中， ab218532在敲除型中膜信号消失，胞质信号仍存（提示非特异） ， 但 AGR-021在两类小鼠中广泛染色 ， 这一结果提示AGR-021在多种组织中均存在非特异性结合，不适用于免疫组化检测。
图1. AGR-021检测小鼠GLP-1R时缺乏特异性
先前研究使用AGR-021通过流式分选GLP-1R⁺ T细胞进行转录组和功能分析 ， 因此，该团队 重复该实验 ， 发现 AGR-021标记的CD4⁺或CD8⁺ T细胞比例在野生型与敲除型中无差异 ， 而 另一常用抗体7F38同样无法区分 ， 即便是高表达GLP-1R的肠上皮内淋巴细胞（IELs），AGR-021也无法特异性标记。随后，研究者分选AGR-021⁺与AGR-021⁻ T细胞进行qPCR检测 ， AGR-021⁺ CD4⁺ T细胞中Glp1r转录本较高，但CD8⁺ T细胞中则无此现象 ， AGR-021⁻群体中仍可检测到Glp1r表达 ， 说明AGR-021在流式细胞术检测小鼠T细胞中的GLP-1R时缺乏足够的特异性。
最后， 该团队 在过表达GLP-1R的细胞系中进行Western blot验证 ， 结果显示 AGR-021在对照和过表达细胞中均出现多条条带（≥6条），其中一条位于110 kDa（与既往报道一致），但55 kDa处无信号 ， 而 ab218532：仅在过表达细胞中清晰识别55 kDa条带 ， 进一步 证明AGR-021在蛋白质水平上也缺乏特异性。
图2. AGR-021 用于 Western blot 实验检测 蛋白质水平 方面 缺乏特异性
综上，这项工作通过多技术平台、多组织类型、多基因型对照，系统揭示了AGR-021抗体在检测小鼠GLP-1R方面的严重局限性：既不特异，也不敏感。这一结果对领域内具有重要警示意义， 比如：1）需要 重新评估既往研究 ， 尤其是那些依赖AGR-021分选T细胞并得出功能结论的研究，需谨慎对待； 2）强调了 抗体验证的必要性 ， 必须使用基因敲除模型、多种技术正交验证（如原位杂交、荧光配体探针等）；3 ） 物种与条件依赖性：本研究仅针对小鼠，不同物种、不同细胞类型中抗体表现可能不同 等。科学的研究成果是 建立在可靠的试剂与严谨的验证之上 的 。
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2025.06.012财富家
制版人： 十一
参考文献
1. Ben Nasr, M., Usuelli, V., Dellepiane, S., Seelam, A.J., Fiorentino, T.V., D’Addio, F., Fiorina, E., Xu, C., Xie, Y., Balasubramanian, H.B., et al. (2024). Glucagon-like peptide 1 receptor is a T cell-negative costimulatory molecule.Cell Metab.36, 1302–1319.e12. https:// doi.org/10.1016/j.cmet.2024.05.001.
2. Baggio, L.L., Yusta, B., Mulvihill, E.E., Cao, X., Streutker, C.J., Butany, J., Cappola, T.P., Margulies, K.B., and Drucker, D.J. (2018). GLP-1 receptor expression within the human heart.Endocrinology159, 1570–1584. https:// doi.org/10.1210/en.2018-00004.
3. Panjwani, N., Mulvihill, E.E., Longuet, C., Yusta, B., Campbell, J.E., Brown, T.J., Streutker, C., Holland, D., Cao, X., Baggio, L. L., and Drucker, D.J. (2013). GLP-1 receptor activation indirectly reduces hepatic lipid accumulation but does not attenuate development of atherosclerosis in diabetic male ApoE-/- mice.Endocrinology154, 127–139. https://doi.org/10.1210/en.2012-1937.
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